W 1542 r. Paweł III powołał komisję złożoną z sześciu kardynałów, która miała czuwać nad sprawami wiary (bulla Licet ab initio z 21 lipca 1542 r.). Komisja ta, znana pod nazwą „Świętej Inkwizycji Rzymskiej i Powszechnej”, miała początkowo charakter wyłącznie trybunału do spraw herezji i schizmy.
Począwszy od 1555 r. Paweł IV znacznie rozszerzył zakres jej działania, przekazując jej kompetencje do rozstrzygania kwestii moralnych różnego rodzaju.
W 1571 r. Pius V utworzył Kongregację ds. reformy Indeksu Ksiąg Zakazanych. Zadanie to, początkowo przypisywane inkwizycji, było spełniane przez tę nową dykasterię aż do jej zniesienia w 1917 r.
Po reformie Kurii Rzymskiej przeprowadzonej przez Sykstusa V (bulla Immensa aeterni Dei z 22 stycznia 1588 r.) działalność inkwizycji została rozszerzona na wszystko, co mogło bezpośrednio lub pośrednio dotyczyć wiary i moralności.