Papst Paul III. errichtete 1542 eine Kommission von sechs Kardinälen mit dem Auftrag, über die Glaubensfragen zu wachen (Bulle Licet ab initio vom 21. Juli 1542). Diese Kommission mit dem Namen „Heilige Römische und Allgemeine Inquisition“ hatte zu Beginn ausschließlich die Bedeutung eines Gerichts für die Fälle von Häresie und Schisma.
Ab 1555 erweiterte Paul IV. ihren Tätigkeitsbereich um die Beurteilung verschiedener moralischer Fragen.
1571 schuf Hl. Pius V. zusätzlich die Kongregation für die Reform des Index der verbotenen Bücher. Diese Aufgabe, die am Anfang die Inquisition wahrgenommen hatte, wurde von der Indexkongregation bis zu ihrer Aufhebung 1917 ausgeübt.
In der Folge der von Sixtus V. durchgeführten Neuordnung der Kurie (Bulle Immensa aeterni Dei vom 22. Januar 1588) erweiterte sich die Tätigkeit der Inquisition auf alles, was direkt oder indirekt den Glauben und die Moral betrifft.